La dinámica de fluidos altera la longitud corporal de Caenorhabditis elegans a través de TGF

npj Microgravity volumen 2, Número de artículo: 16006 (2016) Citar este artículo

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El desgaste del músculo esquelético es un obstáculo importante para la exploración espacial a largo plazo. Al igual que los astronautas, el nematodo Caenorhabditis elegans muestra efectos musculares y físicos negativos cuando se encuentra en microgravedad en el espacio. No está claro qué moléculas de señalización y comportamiento(s) causan estas alteraciones negativas. Aquí estudiamos moléculas de señalización clave involucradas en alteraciones del físico de C. elegans en respuesta a la dinámica de fluidos en experimentos en tierra. La colocación de gusanos en el espacio en un acelerador 1G aumentó una cadena pesada de miosina, myo-3, y un factor de crecimiento transformante-β (TGF-β), dbl-1, la expresión del gen. Estos cambios también ocurrieron cuando los parámetros fluidodinámicos viscosidad/resistencia al arrastre o la profundidad del cultivo líquido aumentaron en el suelo. Además, la longitud del cuerpo aumentó en mutantes de colágeno de la cutícula de la pared del cuerpo y de tipo salvaje, rol-6 y dpy-5, cultivados en cultivo líquido. Por el contrario, la longitud del cuerpo no aumentó en los mutantes TGF-β, dbl-1 o vía de señalización aguas abajo, sma-4/Smad. De manera similar, se requería un receptor de dopamina similar a D1, DOP-4, y un canal mecanosensorial, UNC-8, para aumentar la expresión de dbl-1 y alterar el físico en cultivo líquido. Como las tasas de contracción de C. elegans son mucho más altas cuando nada en líquido que cuando se arrastra sobre una superficie de agar, también examinamos la relación entre la mejora de la longitud corporal y la tasa de contracción. Los mutantes con tasas de contracción significativamente reducidas eran típicamente más pequeños. Sin embargo, en los mutantes dop-4, dbl-1 y sma-4, las tasas de contracción aún aumentaron en líquido. Estos resultados sugieren que la señalización neuromuscular a través de TGF-β/DBL-1 actúa para alterar el físico del cuerpo en respuesta a las condiciones ambientales, incluida la dinámica de fluidos.

El físico de un individuo se forma durante largos períodos tanto por estímulos externos como por la marcha locomotora. El desgaste óseo y muscular son adaptaciones fisiopatológicas inevitables en microgravedad, por ejemplo, vuelos espaciales, y con inactividad, por ejemplo, en personas postradas en cama.1–4 El desgaste de estos tejidos es un obstáculo importante para la exploración espacial a largo plazo. La microgravedad, en particular, reduce notablemente la carga mecánica y también produce cambios drásticos en la dinámica de fluidos, incluidas las fuerzas hidrostáticas. Sin embargo, aún no está claro qué moléculas de señalización y comportamiento(s) causan estas adaptaciones fisiopatológicas.

El ejercicio acuático es una de las mejores maneras de lograr una fuerza corporal óptima y mejorar el vigor. Dicho ejercicio involucra la aplicación física de dinámica de fluidos, particularmente fuerzas hidrostáticas y resistencia al arrastre que acompañan a la viscosidad del líquido, y es efectivo no solo en individuos sanos sino también en pacientes postrados en cama.5–10 Aunque muchos estudios recientes han evaluado parámetros dinámicos de flujo como estímulos físicos, los mecanismos para la percepción de estos estímulos y la transducción de señales de estos estímulos a la formación de hueso y músculo esquelético, el físico mejorado y la fuerza siguen sin estar claros.

Caenorhabditis elegans es un nematodo de vida libre que también es un animal de laboratorio ampliamente utilizado. La longitud del cuerpo se puede alterar a través de una vía de señalización altamente conservada del factor de crecimiento transformante-β (TGF-β)/DBL-1 Smad factor de transcripción. líquido y el otro cuando gatea sobre una superficie.17–21 La transición de la marcha de natación a la marcha de gateo y viceversa está controlada por aminas biogénicas como una respuesta adaptativa a corto plazo.21 C. elegans también hace adaptaciones a corto plazo a locomoción en respuesta a estímulos mecánicos suaves a través de un complejo mecanosensorial compuesto por los canales iónicos de degeneración, MEC-4 y MEC-10, que se encuentran en las neuronas sensibles al tacto.22–25 Los gusanos también generan respuestas adaptativas a largo plazo. Por ejemplo, encontramos de manera reproducible que los vuelos espaciales inducen una expresión reducida de algunos genes musculares, 26–29 incluidos los filamentos musculares gruesos, otros elementos del citoesqueleto y enzimas metabólicas mitocondriales. Estos cambios en la expresión de genes parecían ser consistentes con los cambios en la longitud del cuerpo y la acumulación de grasa durante los vuelos espaciales.29

Este estudio investigó la alteración de la miosina muscular y la expresión del gen TGF-β en respuesta a las propiedades dinámicas de los fluidos (microgravedad, viscosidad/resistencia al arrastre y profundidad del cultivo líquido). También comparamos la relación entre el físico corporal establecido y los diferentes comportamientos de movimiento mostrados por lombrices cultivadas en líquido y en superficie de agar húmedo, nadando y arrastrándose, respectivamente. Finalmente, exploramos la hipótesis de que la señalización neuromuscular a través de TGF-β/DBL-1 modula el físico alterado en respuesta a las propiedades dinámicas de fluidos.

En nuestro experimento espacial de interferencia de ARN de C. elegans (CERISE), los animales en etapa de larva L1 se cultivaron sincrónicamente hasta la edad adulta en medios líquidos durante 4 días, ya sea en microgravedad o en una centrífuga 1G a bordo del Módulo Experimental Japonés de la Estación Espacial Internacional.30,31 El Las larvas del nematodo L1 se enviaron a la Estación Espacial Internacional a bordo del transbordador espacial Atlantis, STS-129, el 16 de noviembre de 2009. Los cultivos se iniciaron el 20 de noviembre de 2009, se congelaron 4 días después y las muestras congeladas posteriores al cultivo fueron devueltas por el Space Shuttle Endeavour, STS-130, el 21 de febrero de 2010. Los análisis de expresión de micromatrices indican que los niveles de filamentos gruesos musculares, elementos del citoesqueleto y enzimas metabólicas mitocondriales disminuyeron en relación con los cultivos paralelos en la centrífuga 1G (intervalo de confianza del 95 % (P⩽0,05): número de acceso GSE71770 en GEO).29 Además, la longitud del cuerpo de los gusanos cultivados en microgravedad fue ligeramente (~5,5 %) pero significativamente menor en comparación con los gusanos cultivados en la centrífuga 1G integrada.29 En este estudio, confirmamos que la cadena pesada de miosina, myo-3, y TGF-β, dbl-1, la expresión génica se redujo, 60% y 70%, respectivamente, en microgravedad versus en la centrífuga (Figura 1a). Estas observaciones sugieren que la reducción de la longitud corporal podría deberse a adaptaciones fisiopatológicas a la microgravedad causadas por la represión transcripcional de genes musculares y/o la disminución de la señalización de TGF-β, que es causada por la disminución de la expresión de dbl-1.

La restauración de 1G en la Estación Espacial Internacional aumenta la expresión de los genes myo-3 y dbl-1 tal como lo hace el aumento de la viscosidad del líquido y la profundidad del cultivo en experimentos terrestres. Los niveles de expresión de los genes myo-3 y dbl-1 se controlaron en animales de tipo salvaje (adultos de 4 días) que volaron al espacio y se cultivaron en líquido con o sin aceleración de 1G durante el experimento espacial de ARNi de C. elegans (CERISE) en el módulo de experimentos japonés KIBO30,31 (a). Se cultivaron animales de tipo salvaje desde la etapa larval L1 durante 4 días en diferentes viscosidades líquidas con 1,0 % (36,1 cSt) y 1,5 % (123,3 cSt) de metilcelulosa (b). Los animales de tipo salvaje se cultivaron desde la etapa larvaria L1 durante 4 días en agar de medio de crecimiento de nematodos (NGM) OP50 sumergido en la profundidad indicada de medio líquido OP50 NGM (c). Las alteraciones en la expresión de los genes dbl-1 y myo-3 se controlaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real.

En experimentos en tierra, para estudiar el efecto de un parámetro dinámico de fluidos, la resistencia al arrastre, en la expresión de los genes myo-3 y dbl-1, se cultivaron gusanos de tipo salvaje durante 4 días después de la etapa larval L1 bajo diferentes viscosidades líquidas. (1,0 cSt (0% metilcelulosa), 36,1 cSt (1,0% metilcelulosa) y 123,3 cSt (1,5% metilcelulosa)). La expresión del gen myo-3 aumentó significativamente a una viscosidad de 36,1 cSt y aumentó moderadamente a 123,3 cSt. La expresión del gen dbl-1 aumentó significativamente modestamente en ~20 % a 123,3 cSt (Figura 1b). La tasa de crecimiento y los tiempos de desarrollo no se vieron significativamente alterados por la viscosidad, y todas las larvas L1 se habían desarrollado hasta convertirse en hermafroditas adultos maduros y grávidos a los 4 días. En adultos grávidos, la longitud del cuerpo no aumentó tanto como se esperaba para los animales criados en metilcelulosa al 1,5 %, lo que quizás sugiera que las concentraciones más altas de metilcelulosa deshidratan a los gusanos y/o inhiben la digestión y la absorción.

Para estudiar los efectos de alterar la profundidad del cultivo líquido, se cubrió agar con medio de crecimiento de nematodos (NGM) OP50 con medio líquido OP50 NGM adicional (0,6, 1,2 o 1,8 mm de profundidad). En la condición más superficial, los gusanos estaban completamente cubiertos de líquido y su comportamiento en movimiento cambió a nadar. En adultos grávidos (día 4), la expresión de los genes myo-3 y dbl-1 aumentó con el aumento de la profundidad del cultivo líquido (Figura 1c), con una expresión máxima observada alcanzada a 1,2 mm. Las longitudes corporales de los gusanos cultivados en diferentes profundidades de líquido fueron ligeramente pero no significativamente mayores (0,6 mm: 1,35±0,06 mm, 1,2 mm: 1,36±0,07 mm, 1,8 mm: 1,37±0,04 mm, n=21 gusanos por grupo, P> 0.1). Estos resultados demuestran que el nematodo C. elegans puede alterar la expresión muscular y del gen TGF-β en respuesta a parámetros dinámicos de flujo. Sin embargo, los datos de expresión génica y longitud corporal para gusanos cultivados a diferentes profundidades sugieren que la respuesta a la profundidad del cultivo se satura una vez que los gusanos están completamente sumergidos o es una respuesta de todo o nada.

Aunque la alteración de los parámetros dinámicos de flujo aumentó la expresión de myo-3 y dbl-1 (Figura 1), la magnitud de los cambios significativos en respuesta al cultivo en líquido sobre el suelo fue pequeña. Con el fin de explorar más a fondo si y cómo C. elegans altera la expresión génica y el físico del cuerpo en respuesta a diferentes estímulos ambientales y comportamiento en movimiento, medimos los niveles de expresión génica y la longitud del cuerpo de gusanos de tipo salvaje cultivados en medio líquido de profundidad fija o en una superficie de agar húmedo como se describe en Métodos. El cultivo se produjo en paralelo con larvas L1 eclosionadas en placas de agar y luego cultivadas en líquido o en agar. La tasa de crecimiento y los tiempos de desarrollo no fueron significativamente diferentes entre las condiciones de cultivo, ya que todas las larvas se convirtieron en adultos jóvenes hermafroditas 3 días después del inicio del cultivo, como lo demuestra el inicio de la producción de huevos. Sin embargo, la longitud del cuerpo en el día 4 (etapa de adulto grávido) fue significativamente mayor para los animales cultivados en medio líquido que en agar húmedo (Figura 2a,b); esta diferencia persistió en los puntos de tiempo posteriores (5 y 6 días; Figura 2c). Los niveles de expresión de un gen de cadena pesada de miosina, myo-3, y su factor de transcripción corriente arriba, hlh-1, también fueron significativamente más altos en animales cultivados en líquido que en agar (Figura 2d,e). Los niveles de expresión de la proteína miosina aumentaron de forma similar en 1,6 veces para los animales cultivados en líquido frente a agar (1,24 veces en líquido y 0,78 veces en agar en comparación con la proporción relativa de una proteína ribosómica).

Alteraciones en la longitud corporal y los niveles de expresión génica de myo-3 y hlh-1 en C. elegans cultivadas en diferentes condiciones de cultivo. Hermafrodita adulto grávido de tipo salvaje cultivado en placa de agar húmedo (a, indicado en rosa) o en cultivo líquido (b, indicado en azul), durante 4 días a partir de la etapa larval L1. ( c ) Las longitudes corporales aumentaron significativamente con el cultivo líquido versus el cultivo en agar. Las alteraciones en los niveles de expresión de los genes myo-3 (d) y hlh-1 (e) se controlaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los puntos de datos y las barras de error indican las medias ± sd (n = 60 gusanos por punto de tiempo, ** P≤0.01).

DBL-1 es un miembro de la familia de proteínas TGF-β. Este, junto con su vía de señalización, es un regulador conocido de la longitud corporal de C. elegans.11–16 Para determinar si se requería DBL-1 para la alteración de la longitud corporal observada, medimos la longitud de dbl-1 (semana 70) y ( nk3) mutantes después de cultivar en líquido o en agar. También medimos mutantes sma-4 (e729), ya que SMA-4 es un componente de factor de transcripción aguas abajo conocido de la cascada de señalización DBL-1 que controla el tamaño del cuerpo. A diferencia del tipo salvaje (Figuras 2 y 3), la longitud corporal de estos mutantes no aumentó en cultivo líquido (Figura 3), lo que implica que se requieren dbl-1 y sma-4 para la alteración de la longitud corporal en respuesta al cultivo líquido. .

DBL-1 y su vía de señalización son necesarios para las alteraciones de la longitud corporal de C. elegans en respuesta a las condiciones de cultivo líquido. dbl-1(wk70) adulto grávido hermafrodita cultivado en placas de agar húmedas (a) o en cultivo líquido (b) durante 4 días, a partir del estadio larvario L1. ( c ) Se midieron las longitudes corporales de tipo salvaje, dbl-1 (wk70), dbl-1 (nk3) y sma-4 (e729) cultivadas en líquido o en agar durante 4 días. Las barras y las barras de error indican las medias y sd (n=30 gusanos por condición; **P≤0.01).

Debido a que el trabajo anterior informó que DBL-1 controla la expresión de varios genes, incluidos los que codifican colágenos asociados a la matriz extracelular, a continuación investigamos si el cultivo líquido suprime los fenotipos regordetes y de rodillos en mutantes de colágeno. Las longitudes corporales de los mutantes dumpy dpy-5 (e907) y rol-6 (su1006) aumentaron notablemente en cultivo líquido versus agar (Figura 4a-d). Además, el cultivo líquido redujo la frecuencia del fenotipo de rodillo diestro inducido por rol-6 (su1006) (Figura 4b). En conjunto, los resultados que se muestran en las Figuras 1, 2 y 3 sugieren que el cultivo líquido altera el físico de C. elegans a través de la activación de la señalización de TGF-β/DBL-1 (Figura 3), no solo en términos de expresión de miosina muscular (Figura 2 ) sino también en términos de matriz extracelular/deposición de colágeno (Figura 4).

Los fenotipos voluminosos y enrollables se ven mitigados por el cultivo líquido. dpy-5(e907) (a, b), y RW1596 rol-6 (su1006) y Pmyo-3::GFP::myo-3 (c, d), los animales se cultivaron en agar húmedo (a, c) o en cultivo líquido (b, d) durante 4 días, a partir del estado larvario L1. (e) Se midieron las longitudes de sus cuerpos. ( f ) Se contó la frecuencia del fenotipo de rodillo diestro en RW1596. Las barras y las barras de error indican las medias y sd (n=30 gusanos por condición; *P≤0.05, **P≤0.01).

En C. elegans, un canal de iones de sodio epitelial/degenerina compuesto por MEC-4 y MEC-10 funciona como un mecanosensor para estímulos físicos (p. ej., tacto).22–25 Para determinar si los miembros de la familia de degenerina actúan como mecanosensores en respuesta a Se evaluaron los parámetros dinámicos, las alteraciones de la longitud corporal en respuesta al cultivo líquido en mutantes del canal de degenerina (mec-4(e1611), mec-10(e1515) y unc-8(e15)). Mientras que tanto mec-4(e1611) como mec-10(e1515) mostraron una mayor longitud corporal en respuesta al cultivo líquido, unc-8(e15) no mostró un aumento significativo en la longitud corporal (Figura 5).

La degenerina UNC-8 es necesaria para las alteraciones de la longitud corporal de C. elegans. mec-4(e1611), mec-10(e1515) y unc-8(e15) se cultivaron durante 4 días en cultivo líquido o agar, a partir del estadio larvario L1. Se midieron las longitudes del cuerpo. Las barras y las barras de error indican las medias y sd (n=30 gusanos por condición; **P≤0.01).

La transición de C. elegans entre los característicos pasos de gateo y natación está controlada por las aminas biogénicas, la dopamina y la serotonina.21 Por lo tanto, medimos las alteraciones de la longitud corporal en animales con mutaciones en los genes que codifican la enzima biosintética de la serotonina, tph-1(mg280), un miembro de la familia de receptores de serotonina/octopamina, ser-5 (ok3087), y los receptores de dopamina similares a D1, dop-1 (vs101) y dop-4 (tm1329). dop-4(tm1329) no mostró alteraciones dependientes del cultivo en la longitud del cuerpo (Figura 6), lo que sugiere que la DOP-4 también es necesaria para la alteración del físico. Por el contrario, las longitudes corporales aumentaron significativamente en cultivo líquido frente a agar para tph-1 (mg280), ser-5 (ok3087) y dop-1 (vs101) (Figura 6). Luego investigamos el impacto de otros factores en la longitud del cuerpo en el sistema de cultivo líquido, comenzando con la detección de oxígeno y nutrientes. Para ello, utilizamos animales con mutaciones en los genes que codifican el factor de respuesta a la hipoxia, hif-1(ia4), un péptido similar a la insulina/IGF-1, ins-7(ok1573), y un regulador transcripcional clave que actúa aguas abajo de la insulina. /Señalización mediada por IGF-1, daf-16(mu86). En todos los casos, la longitud corporal aumentó en respuesta al cultivo líquido en estos mutantes (Figura 6). Un mutante del receptor de rianodina unc-68(r1161)32, que es lento y flácido, también mostró una mayor longitud corporal en cultivo líquido (Figura 6). Estos resultados sugieren que la alteración del físico de C. elegans en respuesta al cultivo líquido requiere alguna señalización neuromuscular, pero es en gran medida distinta de la detección de oxígeno y nutrientes.

Varios mutantes de C. elegans muestran aumentos de longitud corporal de tipo salvaje en cultivo líquido frente a cultivo en agar. De todos los mutantes probados, solo dop-4 (tm1329) no logró aumentar su longitud corporal después de 4 días en cultivo líquido (n=30 gusanos por condición; **P≤0.01).

Finalmente, evaluamos si las mayores tasas de contracción observadas en los gusanos nadadores estaban involucradas en la mejora de la longitud corporal. El ciclo de flexión de la cabeza dorsal y ventral (DV) se contó en varios mutantes (Tabla 1): señalización de TGF-β (dbl-1 y sma-4); un canal de degeneración (unc-8); un receptor de dopamina similar a D1 (dop-4); y un receptor de rianodina (unc-68). unc-8(e15) a menudo se curvaba anormalmente y no alteraba el ciclo DV ni en líquido ni en la placa de agar, esto se correspondía con el mutante que no mostraba el aumento normal en el ciclo al nadar (Tabla 1). Por el contrario, otros mutantes de degenerina, mec-4 y mec-10, no fueron significativamente diferentes del tipo salvaje en el movimiento o aumento del ciclo en respuesta al movimiento de natación (mec-4 (e1611): 0,53 ± 0,15 Hz en agar y 1,56 ± 0,19 Hz en líquido; mec-10 (e1515): 0,53±0,19 y 1,53±0,13 Hz, P>0,1). Estas observaciones sugieren que los mutantes que no muestran un aumento en la longitud del cuerpo (p. ej., unc-8) tampoco muestran un aumento en el ciclo DV cuando nadan. Sin embargo, la señalización de TGF-β (dbl-1 y sma-4) y los mutantes del receptor de dopamina similar a D1 (dop-4), que tampoco mostraron un aumento en la longitud del cuerpo, de hecho, mostraron y aumentaron en DV ciclo al nadar. Por lo tanto, aunque el aumento del ciclo DV cuando la natación no es suficiente para aumentar la longitud corporal (p. ej., dbl-1, dop-4 y sma-4), puede ser necesario (p. ej., unc-8).

Para evaluar más a fondo el requisito de señalización de TGF-β, medimos cuantitativamente la expresión génica de TGF-β, dbl-1 y su señal aguas abajo, wrt-4.33 Como se muestra en la Tabla 1, unc-8(e15) y dop-4( tm1392), cuya longitud corporal no aumentó en respuesta al cultivo líquido (Figuras 5 y 6), no mostró inducción de dbl-1 o wrt-4. Estos resultados sugieren que unc-8 y dop-4 actúan aguas arriba de dbl-1 para controlar la respuesta al cultivo en líquido. De acuerdo con esto, dbl-1 y sma-4 mostraron la inducción de dbl-1, presumiblemente porque los sensores aguas arriba están intactos en estos mutantes, pero no mostraron la inducción de wrt-4, lo que confirma que se requiere la señalización de TGF-β para wrt- 4 inducción en respuesta al cultivo líquido. Por el contrario, unc-68(r1161) aumentó la longitud corporal y la expresión génica (Tabla 1, Figuras 5 y 6). Estos resultados sugieren que para extender la longitud corporal en cultivo líquido: (1) la señalización de TGF-β/DBL-1 es esencial, pero (2) puede ser necesario aumentar el ciclo DV mediante el comportamiento de natación, pero no es suficiente.

C. elegans es un nematodo de vida libre que se encuentra en el suelo y en la vegetación en descomposición, y persiste en partículas con superficies húmedas y en condiciones acuáticas. C. elegans muestra al menos dos modos de andar distintos, nadando en líquidos y arrastrándose en superficies.17–21 Se requiere tensión superficial para retener a C. elegans en superficies húmedas y se prevé que sea del orden de 10 000 × G.28 ,34,35 Por lo tanto, la marcha de arrastre en superficies probablemente resulte de las fuerzas más grandes causadas por la tensión superficial en comparación con la dinámica del flujo en el líquido.20 La marcha de arrastre es provocada por grandes cargas externas, y se usa una fuerza muscular sustancial para contrarrestar la carga externa. y mover el cuerpo. En apoyo de esta especulación, se ha observado previamente una transición continua de la marcha entre ondulaciones que se asemejan a nadar o gatear con una viscosidad líquida creciente.20

Estas observaciones, sin embargo, no explican completamente por qué el físico de C. elegans se altera significativamente en líquido frente a agar. La transición de la marcha, por necesidad, debe ser una respuesta adaptativa a corto plazo, mientras que la alteración del físico suele ser una respuesta adaptativa a largo plazo.

Gatear y nadar son comportamientos bastante diferentes. C. elegans arrastrándose sobre agar húmedo exhibe curvas dorsoventrales en forma de S con una amplitud promedio de 135° a una frecuencia de 0.5–0.8 Hz.18,21 En contraste, C. elegans nadando muestra curvas dorsoventrales en forma de C. postura con una amplitud promedio de 45° a una frecuencia de 1,7 a 2,1 Hz.18,21 Además, C. elegans nada continuamente durante períodos prolongados, 45 min más.21 Estos comportamientos cuantitativamente distintos en frecuencia, amplitud y propagación de curvas dorsoventrales puede provocar distintas respuestas adaptativas a largo plazo que alteran la expresión génica para dar forma a un físico más adecuado para el medio ambiente.

Cuando se cultivaron en líquido, la longitud corporal y los niveles de expresión del gen de la cadena pesada de miosina myo-3 y su activador transcripcional, hlh-1 (MyoD) aumentaron en comparación con los cultivos en agar. Estas parecerían ser una respuesta adaptativa a largo plazo al crecimiento en el entorno líquido. Una vía de señalización clave ya conocida para modular la longitud del cuerpo de C. elegans, la vía de señalización TGF-β/DBL-1,11–16 era necesaria para la alteración física en respuesta al cultivo líquido y se inducía transcripcionalmente en respuesta al cultivo líquido. La inducción de la expresión de dbl-1 en respuesta al cultivo líquido parece deberse a la dinámica de fluidos, ya que la expresión de dbl-1 se indujo tanto por el aumento de la viscosidad como por la profundidad del cultivo líquido (Figura 1). Curiosamente, la expresión de dbl-1 fue inducida por cultivo líquido en una centrífuga 1G a bordo de la Estación Espacial Internacional en comparación con la microgravedad espacial (Figura 1). Es posible que el aumento de la presión hidrostática en los gusanos cultivados con una aceleración de 1G en el espacio haya afectado la expresión de dbl-1. Como no hemos medido la presión hidrostática, se necesitan experimentos futuros que examinen la alteración de la expresión de dbl-1 en respuesta a la presión hidrostática.

En C. elegans, los miembros de la familia de canales de Na+ epiteliales/degenerina actúan como mecanosensores para diversos estímulos físicos. Por lo tanto, teníamos curiosidad por saber si podrían estar detectando dinámicas de fluidos y posiblemente afectando la expresión de dbl-1. MEC-4 y MEC-10 forman un heterocomplejo de subunidades formadoras de poros de iones en neuronas sensibles al tacto22–24 y este complejo es esencial para la respuesta a la hipergravedad.25 Sin embargo, nuestro hallazgo de que el tamaño corporal aumenta en cultivo líquido incluso en ausencia de el heterocomplejo MEC-4/10 sugiere que este complejo no es necesario para alterar el físico en respuesta a la dinámica de fluidos. En cambio, encontramos que otros miembros de la familia de canales de Na+ epiteliales/degenerarina, específicamente UNC-8, son necesarios para el físico alterado en respuesta a la dinámica de fluidos (Figura 1). Esto sugiere que pueden estar actuando como mecanorreceptores que responden a fluidos. UNC-8 se expresa en las neuronas motoras del cordón ventral.36–38 Además, TGF-β/DBL-1, que regula de forma dependiente de la dosis el tamaño corporal de C. elegans, se expresa principalmente en las neuronas motoras y el anillo nervioso;12 el sitio conocido de la expresión de dbl-1 coincide estrechamente con el sitio conocido de acción de UNC-8. Por lo tanto, el complejo de degenerina UNC-8 podría detectar estímulos físicos de condiciones de cultivo y/o alteraciones de la postura corporal y/o tensión generada por la variación de la forma de andar, lo que lleva a la regulación positiva de DBL-1. El ligando DBL-1 regulado al alza luego actúa, a través de mecanismos conocidos, sobre las células musculares e hipodérmicas para controlar el físico del cuerpo al facilitar la expresión de miosina muscular y colágeno cuticular.

Como otra posibilidad, el comportamiento de natación podría ser necesario para alterar el físico del cuerpo porque los mutantes unc-8 (e15) pierden por completo los comportamientos de movimiento normales tanto en líquido como en una superficie de agar (Tabla 1). Por último, dado que la dinámica de fluidos, en particular las fuerzas hidrostáticas y la resistencia al arrastre que acompañan a la viscosidad del líquido, mejoran la formación de huesos y músculos esqueléticos en personas menos activas,5–10 teníamos curiosidad si esto también era cierto para los gusanos menos activos. De hecho, un mutante lento y flácido, unc-68, mostró un aumento de la longitud corporal en respuesta al cultivo líquido (Figura 6). Esto sugiere no solo que un efecto de dinámica de fluidos independiente de la actividad, posiblemente la facilidad de movilidad facilitada por la flotabilidad, parece estar evolutivamente conservado entre C. elegans y el hombre, sino también que C. elegans podría ser un modelo adecuado para estudiar y combatir el impacto de la inactividad. en el músculo humano.

Trabajos recientes han aclarado que C. elegans emplea aminas biogénicas (dopamina y serotonina) para controlar la transición de la marcha entre gatear y nadar,21 una adaptación a corto plazo. La dopamina es necesaria para iniciar y mantener el gateo en tierra después de nadar en el agua, y la serotonina es necesaria para la transición del gateo al comportamiento de natación. Teníamos curiosidad por saber si esta adaptación a corto plazo también tenía un papel en la adaptación a largo plazo del físico. Mientras que las mutaciones en dop-1, ser-5 y tph-1 mostraron un aumento de longitud corporal de tipo salvaje en respuesta al cultivo líquido, los mutantes dop-4 no mostraron un aumento de longitud. Esto sugiere que se requiere DOP-4 no solo para la adaptación de la marcha a corto plazo, sino también para la adaptación física a largo plazo al cultivo líquido. DOP-4 es un receptor de dopamina similar a D1 que se sabe que está involucrado en la desinhibición inducida por el alcohol de ciertos comportamientos, incluidas las posturas de alimentación y gateo en el agua.39 Por lo tanto, DOP-4 puede funcionar como un componente clave para la adaptación de C. elegans a los ambientes acuáticos participando en respuestas adaptativas tanto a corto como a largo plazo.

C. elegans que crece en líquido, como en la naturaleza, puede estar sujeto a hipoxia y nutrición limitada. Por lo tanto, investigamos si estos factores podrían contribuir a una mayor longitud corporal en cultivo líquido. Sin embargo, las mutaciones en hif-1, ins-7 y daf-16 respondieron como el tipo salvaje, lo que sugiere que ni la detección de oxígeno ni la detección de nutrición contribuían al aumento de la longitud corporal. Esto puede no ser sorprendente dado que UNC-8 y/o DOP-4 parecen estar detectando la dinámica de fluidos y que el tipo salvaje y todos los demás mutantes probados se desarrollaron al mismo ritmo en cultivo líquido o en agar.

En conclusión, nuestros resultados sugieren que UNC-8 y/o DOP-4 pueden funcionar como sensores/transmisores neuronales de propiedades dinámicas de fluidos, incluida la viscosidad/resistencia al arrastre y posiblemente la presión hidrostática. Parece que la activación de estos sensores/transmisores neuronales por propiedades dinámicas de fluidos aumenta la expresión de dbl-1 para aumentar la señalización de DBL-1, lo que provoca un aumento en el tamaño corporal y la expresión de proteínas musculares.

Se usó la cepa C. elegans N2 Bristol como tipo salvaje. Las cepas mutantes fueron las siguientes: derivado BC15777: dpy-5(e907); RW1596: mio-3(st386), stEx30 [mio-3p::GFP+rol-6(su1006)]; LT121: dbl-1 (semana 70); NU3: dbl-1(nk3); DR1369: SMA-4(e729); CB1611: mec-4(e1611); CB1515: mec-10(e1515); CB15: unc-8(e15); ZG31: hif-1(ia4); CF1038: daf-16(mu86); RB1388: ins-7 (ok1573); GR1321: tph-1 (mg280); RB2277: ser-5 (ok3087); LX636: dop-1 (vs101); FG58: dop-4 (tm1392); y TR2170: unc-68(r1161). Estas cepas se obtuvieron del Centro de Genética de Caenorhabditis (Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN, EE. UU.).

Treinta a cincuenta hermafroditas adultos de tipo salvaje o mutantes se transfirieron a una placa de agar con medio de crecimiento de nematodos (NGM) recién preparada (placa de cultivo de plástico de ϕ6 cm) con Escherichia coli cepa OP50 esparcida sobre la superficie como fuente de alimento. Se permitió que los adultos pusieran huevos durante 4 horas a 20 °C; esto produjo al menos 500 huevos en cada plato. Los adultos y la fuente de alimento bacteriano se eliminaron de la placa mediante un suave pipeteo con 2 ml de tampón M9 tres veces. Los huevos restantes se dejaron durante 12 horas adicionales a 20 °C, momento en el que las larvas L1 eclosionadas se recolectaron en 500 μl de tampón M9. Sesenta larvas L1 por condición se cultivaron simultáneamente a 20 °C en una placa de agar OP50 NGM o en un sistema de cultivo NGM líquido de 2 ml que contenía E. coli OP50 (DO600 = 1,0; profundidad del líquido = 0,8 mm) en un plástico de ϕ6 cm. plato de cultura Tres días después del cultivo, el tipo salvaje y todos los demás mutantes probados en este estudio habían crecido hasta la edad adulta joven, como lo demuestra el inicio de la producción de huevos; esto se observó en ambas condiciones de cultivo. Para evitar la inanición, los animales adultos se recogieron con un alambre de platino de ϕ0,2 mm y se transfirieron a un medio nuevo cada día; se produjeron transferencias para ambas condiciones de cultivo.

Para estudiar los efectos de la viscosidad líquida sobre la expresión génica (ver más abajo), se usaron concentraciones finales de metilcelulosa al 1,0 y 1,5 % en 2,0 ml de medio líquido NGM que contenía E. coli OP50 (OD600=1,0). Las viscosidades cinéticas, medidas con un viscosímetro Visoboy2 (LAUDA, Alemania), fueron de 1,0 cSt (mm2/s) para el control OP50 NGM líquido, 36,1 cSt para el 1,0 % de metilcelulosa y 123,3 cSt para el 1,5 % de metilcelulosa.

Para estudiar los efectos de la profundidad del cultivo líquido, el agar OP50 NGM en placas de ϕ6 cm se cubrió adicionalmente con 1,5 ml (~0,6 mm de profundidad), 3,0 ml (~1,2 mm de profundidad) o 4,5 ml (~1,8 mm de profundidad). en profundidad) de medio líquido NGM que contiene E. coli OP50 (OD600=1,0). Desde L1 hasta la edad adulta, todos los animales están completamente cubiertos y muestran un comportamiento de natación incluso en las condiciones más superficiales.

La longitud corporal de C. elegans se evaluó en la edad adulta joven (3 días después de comenzar como larva L1) y los 3 días posteriores. Cada día, un subconjunto de animales cultivados se fijó con paraformaldehído al 1 % durante 30 min a temperatura ambiente y se tomaron imágenes con un microscopio BX51 y una cámara DP71 (Olympus Optical, Tokio, Japón). Las longitudes del cuerpo se midieron utilizando el software de análisis de imágenes CellSens (Olympus). Cada experimento se realizó por triplicado con tres muestras independientes (n total = 60 gusanos por punto de tiempo). El análisis estadístico se realizó en MS Excel (Microsoft Co., Redmond, WA, EE. UU.). La significación estadística se fijó en P<0,05, usando una prueba t de Student de dos colas.

Cada ensayo se llevó a cabo en 10 gusanos adultos, nunca privados de alimento, a los 4 días de larvas L1 cultivadas en líquido o en placa de agar húmedo. El ciclo de flexión de la cabeza DV se contó durante 30 s bajo microscopía estereoscópica como la tasa de contracción de nadar o gatear, justo después de tocar cada placa de cultivo.

El ARN total se aisló el día de cultivo indicado de ~ 300 hermafroditas adultos usando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). El análisis de PCR en tiempo real cuantitativo se realizó con un sistema de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.) y un kit SYBER ExScript RT-PCR (TaKaRa Bio, Shiga, Japón). El nivel de expresión del factor de elongación eef-2 se usó como patrón interno y la proporción relativa de expresión génica para cada gen se calculó como se describe.40 Se usaron los siguientes conjuntos de cebadores para amplificar eef-2, hlh-1, myo- 3, dbl-1 y wrt-4: eef-2 (hacia delante) 5′-GAC GCT ATC CAC AGA GGA GG-3′ y (hacia atrás) 5′-TTC CTG TGA CCT GAG ACT CC-3′; hlh-1 (directo) 5′-GCT CGG GAA CGC GGT CGA-3′ y (reverso) 5′-GGA ATG CTC GCA ACG ATC CGC GA-3′; myo-3 (directo) 5′-ACT CTC GAA GCC GAA ACC AAG-3′ y (reverso) 5′-TGG CAT GGT CCA AAG CAA TC-3′; dbl-1 (directo) 5′-CAG TTT GGC TTC GAT TGC TC-3′ y (reverso) 5′-TGA AGC TGG TCC TCT GTC TG-3′; y wrt-4 (hacia delante) 5′-TGG ATG AGC TCG CAG TGG-3′ y (hacia atrás) 5′-CTC CGT TGT CAA GTG TGA ATT CTA C-3′. Los experimentos de PCR en tiempo real se realizaron por triplicado para cada muestra biológica.

También medimos los niveles de expresión de algunos genes en adultos de 4 días de edad de tipo salvaje que volaron al espacio del CERISE.30,31

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Agradecemos a toda la tripulación del CERISE por su trabajo en STS-129, STS-130 y la Estación Espacial Internacional. El CERISE fue organizado con el apoyo de la JAXA. También agradecemos al Centro Genético de Caenorhabditis elegans por el amable suministro de las cepas mutantes. Este trabajo también fue apoyado por los números de subvención JSPS KAKENHI 26506029, 15H05937, el Programa de Promoción de Innovación Estratégica Interministerial (J150000592), el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (G0801271) y los Institutos Nacionales de Salud (NIH NIAMS ARO54342). Este trabajo fue apoyado por subvenciones del MEXT, el JSPS (15H05937, 26506029), el Programa de Promoción de Innovación Estratégica Interministerial (J150000592) y el Proyecto Experimental de Biología Celular realizado por el Instituto de Ciencias Espaciales y Astronáuticas en JAXA. TE recibió el apoyo del Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (G0801271). NJS fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH NIAMS ARO54342).

Shunsuke Harada

Dirección actual: 9Dirección actual: Facultad de Medicina, Universidad de Kobe, Kobe, Japón.,

Shunsuke Harada y Toko Hashizume: estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.

Departamento de Ciencias Ambientales de la Vida, Escuela de Graduados en Ciencias de la Vida, Universidad de Tohoku, Sendai, Japón

Shunsuke Harada, Kanako Nemoto, Zhenhua Shao, Nahoko Higashitani y Atsushi Higashitani

Servicios de ingeniería avanzados, Tsukuba, Japón

Toko Hashizume

Departamento Cooperativo de Medicina Ambiental Espacial, Escuela de Graduados en Ciencias Médicas y Dentales, Universidad de Kagoshima, Kagoshima, Japón

Toko Hashizume y Akira Higashibata

Departamento de Ciencias del Deporte y la Salud, Facultad de Ciencias Ambientales y de la Vida, Universidad de Exeter, Exeter, Reino Unido

Timoteo Etheridge

Centro MRC/ARUK para la Investigación del Envejecimiento Musculoesquelético y Centro Nacional para la Medicina del Deporte y el Ejercicio, Hospital Royal Derby, Universidad de Nottingham, Derby, Reino Unido

Nathaniel J. Szewczyk

Foro Espacial de Japón, Chiyoda-ku, Japón

keiji fukui

Dirección de Tecnología de Vuelos Espaciales Tripulados, Agencia de Exploración Aeroespacial de Japón, Tsukuba, Japón

Akira Higashibata

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Investigación diseñada por la AtsH. SH, TH, KN, ZS, NH y AkH realizaron análisis de expresión génica y observación microscópica. KF y AkH coordinaron el experimento de vuelo CERISE. SH, AkH, TH, KN, TE, NJS y AtsH analizaron los datos y redactaron el artículo.

Correspondencia a Atsushi Higashitani.

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Harada, S., Hashizume, T., Nemoto, K. et al. La dinámica de fluidos altera la longitud corporal de Caenorhabditis elegans a través de la señalización neuromuscular TGF-β/DBL-1. npj Microgravedad 2, 16006 (2016). https://doi.org/10.1038/npjmgrav.2016.6

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Recibido: 30 Abril 2015

Revisado: 14 de diciembre de 2015

Aceptado: 10 de enero de 2016

Publicado: 07 abril 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/npjmgrav.2016.6

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